SHALLOW ROUTE - Évaluation de routine par sWGS à partir de frottis cervicaux en milieu liquide pour le diagnostic précoce du cancer de l'ovaire

Objectif(s) de la recherche et intérêt pour la santé publique

Finalité de l'étude

Objectifs poursuivis

Domaines médicaux investigués

Bénéfices attendus

Etude non interventionnelle prospective, monocentrique.
Après identification des cas, les données des patients concernés seront recueillies à partir des dossiers médicaux.

Avant la réalisation de la chirurgie diagnostique et comme le prévoit la prise en charge habituelle les patientes seront informées de la réutilisation de leurs prélèvements. Les données des patientes concernées seront recueillies à partir des dossiers médicaux. Elles auront la possibilité de s’opposer à tout moment à cette réutilisation en contactant le DPO de l’établissement dont les coordonnées figurent dans la note d’information qu’elles ont reçu dans le livret patient.

Les données collectées seront intégrées dans un fichier Access sécurisé par un mot de passe. Un numéro de pseudonymisation sera attribué à chaque patient. Une table de correspondance entre le numéro de pseudonymisation et le numéro de dossier patient sera réalisée dans un autre fichier sécurisé séparé de la base de données (dossier et serveur séparés).
Les bases de données et le tableau de correspondance contenant les numéros de dossiers seront conservés de façon sécurisée sur le système d’information jusqu’à 2 ans après la publication des premiers résultats puis archivées de façon intermédiaire pendant 5 ans avant d’être totalement anonymisées ou détruites.

Constitution de la cohorte
Les patientes prisent en charge à l'IUCT-O pour un cancer séreux de haut grade de l’ovaire à n'importe quel stade et pour lesquelles une chirurgie première (diagnostique ou de cytoréduction) est prévue dans le cadre de leur parcours de soin peuvent être incluses. Pour ces patientes, nous réalisons de façon systématique un prélèvement de tissu tumoral et sain (réalisé dans le parcours de soin du cancer de l’ovaire) et un frottis cervical en milieu liquide (réalisé pour le dépistage d’un cancer du col concomitant).
La technique de cytologie en milieu liquide, qui a remplacé le frottis cervical utilisé pour les études rétrospectives, réduit le nombre d'échantillons insatisfaisants, permet la détection des HPV et de réaliser des tests moléculaires et cytologiques à partir d'un seul échantillon. Les anomalies présentent sur ce prélèvement pourront être considéré comme spécifique de l'origine ovarienne compte tenu de l’exclusion des patientes présentant un cancer autre de l’appareil génital (en particulier les carcinomes endométriaux TP53 mutés). Les échantillons seront transférés au service de pathologie selon le circuit habituel.

Analyse des prélèvements
Les prélèvements tissulaires tumoraux et sains sont fixés dans du formol puis inclus en paraffine. Le diagnostic est réalisé sur le prélèvement tumoral à l’aide de la coloration standard et d’une étude immunohistochimique. Une évaluation de la quantité de matériel tumoral (cellularité et surface tumorale) est effectuée. Après extraction, les ADNs sont quantifiés et qualifiés par la plateforme de biologie moléculaire à l'aide du kit QuBIT DS DNA BR Assay de Thermo Fisher Scientific. Un séquençage de faible profondeur du génome sWGS est réalisé avec une couverture de 2X sur plateforme NEXTSEQ ou NOVASEQ en routine sur le prélèvement de tumeur afin d’évaluer le statut HRD permettant de poser l’indication de prescription des PARPi. La même procédure sera utilisée pour le tissu sain dans le cadre de l’étude. Le prélèvement cervical en milieu liquide est pris en charge selon le protocole de routine dans le cadre du dépistage des cancers du col. Le prélèvement résiduel sera centrifugé et l’ADN sera extrait à partir du culot pour réaliser la technique de sWGS superposable à celle réalisée sur le tissu tumoral.
Les prélèvements résiduels bloc de tissu sain, ADN extrait du tissu tumoral et liquide cervical seront conservés.

Implémentation & analyses à l’aide d’outils, bioinformatique & analyse biostatistique
Les séquences produites seront alignées sur le génome de référence GRCh38 avec le logiciel bwa mem et les duplicats seront retirés avec picard-tools. Les pipelines open source CPA et l’adaptation pour les HGSOC de l'index génomique (GI) publiée par l'équipe ONCOSARC seront implémentés dans l’environnement local disponible. L'analyse comparative sera basée sur les sites d'échantillonnage et les caractéristiques des patients (par exemple, le stade FIGO). L’analyse sera faite en association avec l’équipe bioinformatique du service de pathologie.

Partie biostatistique :
• Critère de jugement principal
Le critère de jugement principal est le taux de patientes présentant un test CPA positif sur le prélèvement tumoral et cervical. Il s’agit du ratio du nombre de patientes présentant un test positif sur le prélèvement tumoral et cervical sur le nombre total de patientes évaluables (i.e. avec les résultats des tests interprétables). L’analyse du tissu servira de contrôle négatif pour chaque patiente.
• Critère de jugement secondaire
Les différentes données clinico-pathologiques (âge, antécédents personnels et familliaux de cancers, type histologique, cellularité et surface tumorale, statut HRD, BRCA, fréquence allélique de la mutation TP53) seront décrites par les statistiques descriptives usuelles en fonction des résultats des prélèvements tumoraux et cervicaux.
• Analyse
Données Démographiques :
Les caractéristiques de la population seront décrites à l’aide des statistiques descriptives usuelles. Les variables quantitatives seront décrites par la médiane, le minimum, le maximum et le nombre de données manquantes et les variables qualitatives par les fréquences, les pourcentages et le nombre de données manquantes de chaque modalité.
Objectif principal :
Le critère de jugement principal est le taux de patientes présentant un test positif sur le prélèvement tumoral (ovaire) et cervical. Il sera présenté sous la forme de nombre, pourcentage et intervalle de confiance à 95% (unilatéral).
Objectif secondaire :
Les différentes données clinico-pathologiques seront décrites par les statistiques descriptives usuelles en fonction des résultats des prélèvements tumoraux et cervicaux. Les variables quantitatives seront décrites par la médiane, le minimum, le maximum et le nombre de données manquantes et les variables qualitatives par les fréquences, les pourcentages et le nombre de données manquantes de chaque modalité. La comparaison entre les groupes sera faite par le test du Chi-2 ou le test exact de Fisher pour les variables qualitatives et par le test de Kruskal-Wallis pour les variables quantitatives.
La corrélation entre les variables quantitatives sera évaluée à l’aide du coefficient de Spearman.

Le cancer de l'ovaire, principalement le carcinome ovarien séreux de haut grade, est la tumeur gynécologique la plus mortelle. En France, environ 5 348 nouveaux cas ont été diagnostiqués en 2023. Le diagnostic est posé entre 50 et 79 ans, à un stade avancé. Les faibles taux de survie sont principalement dus à un retard de diagnostic. Sa croissance est généralement silencieuse, et les symptômes souvent non spécifiques apparaissent à des stades avancés. Le taux de survie globale à 5 ans pour une maladie à un stade avancé est inférieur à 30 %, alors qu'il est supérieur à 90 % pour une maladie de stade I. Environ 20 % des carcinomes ovariens séreux de haut grade sont liés à des mutations germinales des gènes BRCA1/2, avec une incidence de 30 à 70 %, comparer à 1,4 % dans la population générale. L'ESMO recommande une chirurgie de réduction des risques sous forme d’une annexectomie bilatérale pour les patientes présentant une mutation constitutionnelle du gène BRCA1 à l'âge de 35-40 ans et pour BRCA2 à l'âge de
40-45 ans.

Méthode de diagnostic précoce
Même s'il s'agit de la tumeur maligne gynécologique la plus mortelle, il n'existe actuellement aucun test de dépistage validé pour le cancer de l’ovaire. En effet, les stratégies de dépistage impliquant le CA125 et l'échographie trans-vaginale n'ont pas permis de réduire de manière significative le nombre de décès en raison de leur faible sensibilité. A ce jour, il n’existe pas de stratégie de dépistage comparable à celles disponibles pour d'autres cancers, comme la mammographie pour le cancer du sein ou la combinaison du test HPV et du frottis pour le cancer du col de l'utérus.
Le carcinome ovarien séreux de haut grade (HGSOC), qui est le cancer de l’ovaire le plus fréquent (80 % des cancer de l’ovaire) est responsable de 90 % des décès du cancer de l’ovaire. L'hypothèse actuelle de carcinogenèse décrite dans la littérature suggère que les HGSOC se développent principalement à partir de la partie distale de la trompe de Fallope, qui est anatomiquement proche du tractus génital inférieur, où des cellules tumorales ont été observées jusque sur des frottis cervicaux. Dans la quasi-totalité des cas de carcinomes ovariens séreux de haut grade, l’altération moléculaire précoce implique le gène TP53, associée à une instabilité génomique. Il semble y avoir une continuité dans la progression de la maladie, avec l'identification d'une "signature p53 tubaire" et la présence de lésions et carcinomes intraépithéliaux tubaires séreux (STIL/TIC) comme étapes précurseures. Cette progression pourrait se dérouler sur une fenêtre temporelle de plus de 6 ans avant le développement du cancer de l'ovaire.
Le diagnostic de ces cancers, basé sur la progression naturelle et la détection des altérations moléculaires dans des zones accessibles de l'appareil génital, comme le liquide cervical, est donc une piste de choix pour améliorer le taux de survie de cette maladie.

Évaluation de la mutation TP53 dans les frottis cervicaux
Plusieurs études ont démontré la possibilité de détecter précocement les carcinomes ovariens séreux de haut grade par l’analyse de l'ADN tumoral dans les échantillons de frottis cervicaux. Kinde et al. (2013) ont été les premiers à proposer cette idée et ont rapporté la présence des mêmes mutations somatiques de tumeurs de l’endomètre ou de l’ovaire dans les frottis cervicaux. D'autres études ont soutenu cette idée, en retrouvant la mutation TP53 de HGSOC sur des frottis cervicaux réalisés plusieurs années avant le diagnostic5. Ces résultats suggèrent qu'un diagnostic précoce des HGSOC est possible de manière non invasive en détectant les variants pathogènes du gène TP53 dans l'ADN extrait des frottis cervicaux. Cependant, historiquement les frottis conservés sous la forme de lames n'étaient pas destinés à une analyse de l'ADN, pouvant affecter la qualité de l'ADN en raison des procédures de prise en charge technique et de conservation. De plus, compte tenu de la faible proportion d’ADN tumoral sur les frottis, la résolution actuelle des techniques de séquençage de l’ADN nécessite de connaître au préalable les mutations TP53. Autre limite, la présence de mutations pathogènes de TP53 à faible fréquence allélique observées dans des tissus normaux dans des conditions physiologiques augmentant avec l’âge, telles que le mosaïcisme somatique ou l'hématopoïèse anormale. L’ensemble de ces raisons, ne permet pas d’envisager l’évaluation des mutations de TP53 dans les frottis cervicaux comme un outil de dépistage.

Évaluation de l'instabilité génomique dans les frottis cervicaux
En 2023, Paracchini et al. ont utilisé le séquençage complet du génome (whole genome sequencing, WGS) sur l'ADN extrait des frottis cervicaux pour détecter l'instabilité du génome, en étudiant les anomalies du profil du nombre de copies des gènes (copy number profile abnormality, CPA) afin de surmonter les limites liées à la détection des mutations de TP53. Le CPA, qui quantifie l'instabilité globale du génome même en présence d’un faible taux d’ADN tumoral, à l’aide d’un séquençage peu profond du génome (sWGS) élimine la nécessité de connaître les altérations présentent sur la tumeur. Cela en fait un outil de diagnostic rapide, robuste, économique, interprétable et résolutif pour la détection précoce du carcinome ovarien séreux de haut grade.
Leur étude rétrospective multicentrique a évalué les frottis cervicaux archivés de 250 patientes réalisés lors d’un examen gynécologique de routine (pour le dépistage du cancer du col de l’utérus). Les échantillons avaient été collectés chez 77 femmes sans diagnostic de cancer et 113 femmes chez qui avait été diagnostiqué un cancer de l’ovaire. Les valeurs de CPA sur l’ADN des frottis des patientes qui avaient développé un cancer ovarien étaient plus élevées que celles retrouvées sur le frottis des femmes sans diagnostic de cancer. Ce test a détecté avec succès la présence d’un cancer séreux de haut grade de l’ovaire jusqu’à 9 ans avant le diagnostic. Ce test atteint une sensibilité de 75% (95% CI, 64.97 to 85.79), une spécificité de 96% (95% CI, 88.35 to 100.00) et une précision de 81%. Cette étude démontre la faisabilité d'un diagnostic précoce du cancer de l’ovaire à l'aide de l'analyse de l'instabilité génomique sur sWGS dans l'ADN obtenu à partir de frottis du col de l'utérus.
Grace à ce travail, nous voulons confirmer la faisabilité du diagnostic d’un carcinome ovarien séreux de haut grade en utilisant l’instabilité génomique recherchée par sWGS sur l'ADN extrait d’un prélèvement cervical en milieu liquide, sur une série homogène de patientes prises en charge à l’IUCT-Oncopole.

Objectif Principal
L’objectif principal de cette étude est d’évaluer la faisabilité de l’analyse de l’instabilité génomique par séquençage peu profond du génome (sWGS) sur l'ADN extrait d’un prélèvement de tissu tumoral de l’ovaire et/ou d’un frottis cervical en milieu liquide pour le diagnostic d’un carcinome ovarien séreux de haut grade.

Objectif secondaire
Décrire les caractéristiques clinico-pathologiques des patientes en fonction des résultats de l’analyse de l’instabilité génomique sur les prélèvements tumoraux ovariens et cervicaux.

Type de tumeur : Tumeur de l'ovaire
Critères d’inclusion :
- Patientes atteintes d’un carcinome séreux de haut grade ovarien, prises en charge à l’IUCT-O.
- Patientes pour lesquelles une chirurgie première (diagnostique ou de cytoréduction) est prévue.

Critères d’exclusion :
Patientes avec :
- un cancer synchrone de l’endomètre ou du col de l’utérus,
- antécédent de cancer dans les deux dernières années,
- antécédent de cancer gynécologique,
- antécédent de salpingectomie ou hystérectomie ou trachelectomie (ablation du col de l’utérus).

Taille de la population : 50 patientes